如何做好RNA提取

RNA定义：

RNA作为重要的生物大分子，是生命现象的分子基础之一。mRNA在信息传递中起很重要的作用ea6d18。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。很多实验中也需要提取相应样本的RNA作为实验原料。

提取方法：

1.Trizol法异硫氰酸胍/苯酚法

TRIzol试剂有多组分分离作用，最大特点就是可同时分离一个样品RNA/DNA/蛋白质。TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA，用乙醇沉淀中间层可回收DNA，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

2.CTAB法

影响因素：

1.样本材料：

●建议使用新鲜材料。切记使用反复冻融的材料。

●材料长期保存建议液氮，—80℃短期保存

2.样本处理：

根据不同材料选择不同的样本处理

●培养细胞:通常可直接加裂解液裂解

●酵母和细菌:直接液氮研磨，之后用Trizol裂解

●动植物组织:先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。

纯化方案：

●经典的沉淀方法，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解;

●离心柱式纯化方法:抽提速度快，能有效去除影响后续RNA酶反应的杂质。

●磁珠法：同时兼具了样本需求低、操作方便、适配全自动化等优点，目前是尤为常用的核酸纯化方法。

常见问题：

1.RNA降解

●样品取样以及保存是否得当

●裂解液的质量

●外源RNase的污染

●裂解液的用量不足

●组织裂解不充分

●另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA 的降解。

2.OD260/OD280<1.65

●检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低PH值条件下OD280值偏高；

●样品匀浆时加的试剂量太少或样本量过多；

●吸取水相时混入了有机相；

●RNA沉淀未完全溶解。

3.RNA总量低

●样本选择问题：样本自身丰度不足

●样品裂解或匀浆处理不彻底；

●RNA沉淀未完全溶解。

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