本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物羟基自由基水平。用纯化的植物羟基自由基抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物羟基自由基，再与HRP标记的羟基自由基抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的植物羟基自由基呈正相关。

用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算样品中植物羟基自由基浓度。

植物ELISA试剂盒的实验操作步骤如下：

1、标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照图表在小试管中进行稀释。

2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外。

7、温育：操作同3。

8、洗涤：操作同5。

9、显色：每孔先加入显色剂，再加入显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10、终止：每孔加终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11、测定：以空白空调零，依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。