共聚焦显微镜用于光学切片比较厚的样本。直接的问题是：1. 什么是“比较厚的样本”；2. 光学切片到底有多厚？这两个问题在一定程度上是相关的，即假设一份厚样本至少比光学切片厚10倍。生物样本的厚度可以从10米（整只动物）到10纳米（电子显微镜的超薄切片制备）。由于共聚焦显微镜采用了入射光的方法，样本本身的尺寸可能有几厘米或更多，但表面下方的穿透深度取决于材料的不透明度和物镜的工作距离。这就限制了样本大小（z方向），只能考虑使用厚度多为几毫米的样本。光学切片的决定因素是衍射极限。根据各种不同的参数，共聚焦扫描显微镜的真正光学截面厚度可达到约0.5毫米。标准共聚焦应用（如组织切片）当中常用的样本厚度为50 µm以内。

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