炭疽杆菌pagA cap rpoB基因检测试剂盒(三重荧光PCR)

通用名称：炭疽杆菌 pagA、cap、rpoB 基因（BaP/C/R）检测试剂盒(三重荧光 PCR 法) Name：Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

50T/盒

炭疽是由炭疽杆菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一种人兽共患病。BA 在环境中形成芽孢，可长期、稳定地存在于自然界中。由于 BA 的稳定性及其致病性，易引发突发公共卫生事件。目前的 BA 检测方法主要基于病原体的培养、染色镜检、血清学检测等，但这些方法均不适合早期的快速侦检。基于核酸检测的荧光-PCR       技术，因其灵敏度高、操作简单、特异性好，可快速检测炭疽病原，及时控制炭疽疫情。

本试剂盒采用探针法实时荧光定量 PCR 技术，用于水疱内容物、病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液以及增菌液中炭疽杆菌的定性检测。

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，对炭疽杆菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分别设计特异性引物和特异性探针，用荧光 PCR 技术对炭疽杆菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

包装规格

50T/盒

BaP/C/R 反应液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

BaP/C/R 阳性质控品

50μL ×1 管

阴性质控品

250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

ABI、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

炭疽水疱内容物、炭疽病灶渗出物、分泌物、痰液、呕吐物、粪便、血液、脑脊液等；

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 200μL 于 1.5mL灭菌离心管中；咽拭子样品直接取 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性质控品+1 管阳性质控品)，每测试反应体系配制如下表：

试剂

BaP/C/R 反应液

酶液

用量（样本数为 N）

20μL

1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，Cy5，TXR， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

10min

否

2

40 cycles

94℃

15sec

否

55℃

30sec

是

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性质控品)，重新分析结果。

FAM 通道为 pagA 基因检测结果，Cy5 通道为 cap 基因检测结果，TXR 通道为 rpoB 检测结果； 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3. 阳性质控品、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

1. 所有操作严格按照说明书进行；

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3. 反应液应避光保存；

4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

企业名称：上海晅科生物科技有限公司