土霉素酶联免疫试剂盒说明书

一、药物概述及检测原理

欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素族化合物的总量不得超过100ppb，在肾脏，肝脏及鸡蛋中分别不得超过600 ppb，300 ppb及200ppb。

本公司的土霉素酶联免疫试剂盒使用生物技术开发，具有方便、快速、灵敏等特点。

本试剂盒利用土霉素抗体与土霉素可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和土霉素抗体，样本土霉素药物与固定在酶标板上的抗原竞争土霉素抗体，最后加入底物催化显色。此时显色深度与标准品（样本）中土霉素药物的含量成反比。

二、试剂盒内包含组分：

v 10×标准品浓缩液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。

v 96孔酶标板：1块

v 土霉素抗体工作液：1瓶（7mL/瓶）

v 酶标二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）

v 20×浓缩洗涤液：1瓶（30 mL/瓶）

v 20×浓缩复溶液：1瓶（10 mL/瓶）

v 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

v 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

v 终止液：1瓶（7mL）

v 说明书

v 盖板膜

三、用户需要自备的设备和试剂

仪器：

v 酶标仪（检测波长450 nm、630 nm）

v 电子天平（精度：0.01 g）

v 离心机（4000 g及以上）

v 生化培养箱（可调25℃、37℃、60℃）

v 旋涡振荡器

v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排枪）

v 计时器

试剂：（试剂均为分析纯）

v 去离子水

四、试剂盒特异性

试剂盒与其他药物的交叉反应率：

v 土霉素…………………………100%

v 金霉素…………………………240%

v 四环素…………………………200%

v 强力霉素（多西环素）……………………20%

五、样本检测步骤

1. 工作液准备

v 复溶工作液：取1份20×浓缩复溶液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

v 洗涤工作液：取1份20×浓缩洗涤液加去离子水19份按照1:19的比例稀释即得。

v 1 M盐酸溶液：量取1ml浓盐酸加去离子水11ml溶解混匀即得。

2. 样品前处理

组织样本（稀释倍数：12）

Ø 准确称取1±0.01 g均质后的组织样品于10 mL离心管中；

Ø 加入5 mL去离子水，剧烈涡动2min；

Ø 4000 g以上，离心10 min；

Ø 取500ul上清液加入500ul复溶工作液（见5.1）中，涡动10min；

Ø 取50ul进行检测。

蜂蜜样本（稀释倍数：10）

Ø 精确称取1±0.01g蜂蜜样品于10mL离心管中；

Ø 加入2mL去离子水，充分涡动1 min溶解分散；

Ø 取100ul溶解液加入400ul复溶工作液中，涡动1 0S混匀；

Ø 立即取50ul进行检测。

液态奶样本方法一（稀释倍数：10）（同卡那霉素液态奶方法一致）

Ø 将采样好的液态奶样本解冻后于室温静置平衡30min以上；

Ø 将枪头伸入原奶样本下层，小心取出1ml样本加入2ml离心管中（注意：尽量不要取到上层的奶油）；

Ø 加入50μL 1M盐酸（见5.1），强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

Ø 使用离心机室温4000 g以上离心10 min；

Ø 取上层清亮液体50μL加入另一干净离心管中（注意：尽量不要取到最上层的奶油），再加入450μL复溶工作液，强烈震摇1min （或使用涡动仪涡动30s）；

Ø 取50 μL液体进行分析。

液态奶样本方法二（稀释倍数：40）（同卡那霉素液态奶方法一致）

Ø 精确量取50ul液态奶样品于1950ul复溶工作液中；

Ø 充分涡动1 min混匀；

Ø 立即取50ul进行检测。

饲料（牛饲料、猪饲料）（稀释系数：200 ）

Ø 准确称取 1±0.01 g 饲料样品于 50mL 离心管中；

Ø 加入 5 mL 去离子水，充分涡动 2min 至饲料完全分散；

Ø 4000 g 以上，离心 10 min；

Ø 取40 μL上清液于新的离心管中，加入1560μL 复溶工作液 ，充分涡动 30 s；

Ø 立即取 50μL 进行检测。

3. 检测

Ø 准备：将要使用的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品的位置，为减小检测值波动建议做双孔平行实验（每个样本/标准品点两孔），未使用的酶标板条用自封袋密封后，保存于2-8℃环境中以防变质；

Ø 标准品工作液配制：分别取5个2ml离心管，标记为0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；于每个管中加入900ul复溶工作液，于对应管中加入100ul10×标准品浓缩液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；

Ø 加样：向对应微孔中加入标准品工作液/样品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶标二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗体工作液；

Ø 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应30 min；

Ø 洗涤：取出酶标板后小心揭开盖板膜，倒出板孔中液体后，在每孔加 250 μL洗涤工作液，浸泡15-30s后倒掉洗涤工作液，然后再加入洗涤工作液重复洗涤3~4次后，将酶标板倒置于吸水纸上，用力拍干；

Ø 显色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必须按体积1:1充分混合，混合液在10 min内使用，切不可使用金属容器盛装、搅拌试剂以免底物变质失效）；

Ø 孵育：轻轻振荡酶标板10 s，使孔内液体充分混匀后，盖好盖板膜于25℃避光反应15 min；

Ø 终止：在反应后的微孔中加入终止液50μL/孔，底物液由蓝变黄表明终止成功。

Ø 读数：终止后的酶标板应在5 min内用酶标仪读数，建议使用450 nm、630 nm双波长读取酶标板吸光度值。

4. 计算结果

Ø 设各标准品（或样品）的吸光度平均值为B，零标准（浓度为0 ppb的标准品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%为各标准品（或样品）对应的吸光度的百分比：

Ø 使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线。

Ø 将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

六、试剂盒参数

Ø 试剂盒灵敏度：0.4 ppb；

Ø 标准曲线范围：0.4 ppb-10.8ppb；

Ø 板内变异系数：<5%；

Ø 板间变异系数：<15%；

Ø B0吸光度最佳值：>0.8；

Ø 回收率：90%±15%

Ø 样品最低检测限：

组织……………………………约12ppb

蜂蜜……………………………约20ppb

液态奶样本方法一……………约20ppb

液态奶样本方法二……………约40ppb

饲料……………………………约600ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本试剂盒为定量或半定量试剂盒，建议用于大量样本筛查分析。若检测结果为阳性，建议使用仪器方法开展确证实验（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、试剂盒贮存条件

Ø 试剂盒最佳贮存温度为2-8℃，切勿冻存。

Ø 未使用完的酶标板须密封保存2-8℃的环境中。

九、注意事项

Ø 使用试剂盒前，请务必仔细阅读说明书。

Ø 试剂盒使用前，需将盒内各组份置于实验台上回温至室温（25±2℃）（提示：约1 h）。

Ø 试剂使用前需摇匀，混合时应避免出现气泡。

Ø 枪头为一次性用品，为防止试剂交叉污染，检测过程中所用枪头不得重复使用。

Ø 请勿使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。

Ø 样品处理完毕后请立即分析，否则可能影响检测结果。

Ø 底物A液、底物B液均为无色透明液体，若在使用前已变成蓝色，或混合后立即变蓝，说明试剂已污染或变质。

Ø 加样过程在保证精度的前提下一定要迅速，以免反应时间差对检测结果产生影响。

Ø 终止液中含有硫酸，若不小心溅上皮肤或衣物请立即用大量清水冲洗。若不慎入眼，请在彻底清洗后去医院检查。

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