1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测蜂蜜、动物组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾）、牛奶、奶粉和鸡蛋等样本中的恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的恩诺沙星和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗恩诺沙星抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含恩诺沙星含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中恩诺沙星的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.2ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，45min～15min

2.3 检测下限：

组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾） ………0.6ppb

蜂蜜 ……………………………………0.8ppb

牛奶 ……………………………………6ppb

奶粉 ……………………………………10ppb

鸡蛋 ……………………………………6ppb

尿样 ……………………………………1ppb

血清 ……………………………………6ppb

2.4 交叉反应率：

恩诺沙星………………………………100%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

沙拉沙星………………………………2%

2.5 样本回收率：

组织、蜂蜜、牛奶、奶粉、鸡蛋、血清……85%±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液：各1ml

0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

高标准液（红盖）：100ppb …………1ml

酶标记物（红盖）……………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

5×复溶液（黄盖）…………………50ml

说明书 ………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：无水乙腈、正己烷、浓HCl

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：0.15M盐酸溶液

取5ml浓盐酸，加入去离子水混匀，定容至400ml。

配液2：样本提取液

量取10ml 0.15M盐酸溶液（配液1）加入到90ml无水乙腈中混合均匀。

配液3：1×复溶液

将5×复溶液用去离子水5倍稀释（1份复溶液加4份去离子水），用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液4:工作洗涤液

将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 动物组织（鸡肉、猪肉、鱼、虾）处理方法

1）称2.0±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中；

2）加入8ml样本提取液（配液2），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

3）取2ml清澈上层有机相至洁净干燥的10ml玻璃试管中，50-60℃水浴氮气吹干；

4）加入1ml正己烷，振荡2分钟，再加1ml复溶液（配液3），振荡30秒，室温4000转/分离心5分钟；

5）去除上层正己烷，取下层水相50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：2    检测下限：0.6ppb

5.3.2 蜂蜜处理方法

1）取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加6ml样本提取液（配液2），振荡5分钟，使其充分溶解；

2）加入3ml复溶液（配液3），加入11ml二氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分，离心5分钟；

3）吸去上层，取下层有机相8ml至干燥容器中，50-60℃水浴氮气吹干；

4）用1ml复溶工作液溶解干燥的残留物，再加入正己烷1ml混合30秒，室温3000转/分以上，离心5分钟；

5）去除上层取下层50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：2    检测下限：0.8ppb

5.3.3 牛奶处理方法：

1）取25µl样本液与475µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟，使其充分溶解；

2）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：20    检测下限：6ppb

5.3.4 奶粉处理方法：

1）称取0.5±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入

5ml去离子水，振荡，使其充分溶解；

2）取100µl样本液与400µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟；

3）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：50    检测下限：10ppb

5.3.5 鸡蛋处理方法：

1）称取1.0±0.02g均质物至10ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml去离子水，振荡，使其充分溶解；

2）取100µl样本液与400µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟；

3）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数：30    检测下限：6ppb

5.3.6 尿样本处理方法

1）用4ml 1×复溶液与1ml经离心后的清亮尿样本混合，混合30s；

2）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数: 5    检测下限：1ppb

5.3.7 血清处理方法

1）取50µl血清样本与1450µl复溶液（配液3）混合，振荡1分钟；

2）取50µl液体用于分析。

样本稀释倍数: 30    检测下限：3ppb

6 酶联免疫试验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。