【目的与原理]】掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。【[试剂与器材】试剂：1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。2、双缩脲试剂3、标准血清：市售或配制。4、乙mi器材：可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。【实验步骤】1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙mi约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙mi，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”。2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。3、计算将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清总蛋白g/100ml（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清白蛋白g/100ml（3）血清总蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml（4）血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。【方法评估】本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25℃操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后，蛋白质的测定一般均用比色法。【应用意义】白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白>球蛋白，另一些鱼白蛋白<球蛋白，白蛋白与球蛋白的成分按性别、年龄、成长、季节的变化，营养不良、饥饿、应激刺激等所发生变化。【注意事项】1、某些用乙mi及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙mi，而用优质小张中速滤纸在37℃水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1：20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在25℃以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23%硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21%亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g，加蒸馏水到1L）。