细胞侵袭实验准备程序

A、试剂准备:

1、C 缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用 37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液 (例如: 无血清 DMEM 等，用于稀释 A 胶) 稀释 C 缓冲溶液 (10 X) (货号: B-P-00002-C)至 C 缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释 20 倍。使用前放置 37 度水浴槽。

(例如:1 mL C 缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 无血清 DMEM; 如未使用完毕，可保存于 4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A 胶 (1X) 制备 : 将 A 胶 (2X) (货号: B-P-00002-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全溶解。再将 37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液取 0.5 mL，加至 37 ℃已溶解的 0.5 mL A 胶 (2X)，配置成 1 mL 的 A 胶 (1X)。使用前置于 37 度，可降低 A 胶黏度。

(单次使用，勿重复冷冻解冻 A 胶 (1X) )

B、细胞侵袭实验步骤

1、准备适用 24 孔板的 Transwell 装置(例如:康宁 Transwell insert, 8 μm PET membrane)。

2、用 37 ℃已回温的 C 缓冲溶液 (0.5 X)将 A 胶 (1X) 原液体积稀释 5-20 倍，建议一开始可选用 15 倍。

(根据细胞种类做稀释比例对比实验，找出最为适合自己实验体系的稀释倍数，稀释倍数越高，胶体越软，越容易穿透)

3、根据 Transwell 上室底部面积加入步骤 2 的 0.1 mL 稀释后的 A 胶稀释液到 Transwell 上室中。

4、将步骤 4 在 4 ℃ 冰箱孵育 2-3 小时。

5、在 Transwell 上室中加入 0.1 mL 无血清的细胞悬液，使细胞最终浓度约 7.5 x 10^4 cells/well.。

6、在 Transwell 下室中加入 0.8 mL 含 10 %血清的细胞培养液做为 chemoattractant，吸引细胞进行迁移及分泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。

(对照组为 Transwell 下室中加入含 0.8ml 无血清的细胞培养液)。

7、将细胞培养板在 37 ℃, 5 % CO2 培养箱孵育 24-48 小时。

8、移除培养液，以 PBS 清洗 2 次。

9、用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞。

10、加入 1 ml 100 % 甲醇室温固定 30 分钟,再以 PBS 清洗 2 次。

11、加入 1 ml 0.1 % 结晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 结晶紫) 室温染色 20 分钟，再以 PBS 清洗 2 次。

12、将 Transwell 移至载玻片上，在显微镜下随机 6-9 个视野观察计算迁移的细胞数。

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