五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）说明书

u  产品说明

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为 103 CFU/ml。

◆    产品组成（96 测试）

◆   所需仪器

ABI ，BioRad，TaKaRa 等 PCR 扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量 PCR 仪进行定性判读时则无需电泳设备）

◆   自备耗材和仪器

①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④ 离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴。

◆   样品处理

参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组 DNA 提取系列产品。

◆   实验操作

1.试剂配制（试剂配制区，放置于冰盒中进行）取出各管试剂，将试剂完全解冻，离心 30s。取 12×(所待检样品数+3)的 PCR 反应管，按 12 个一组排列并编号，依次向各管中加入 23μL 的 12 种反应液。

2.添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）向每管反应液中分别加入 2μL 模板（或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中）。加样示例：（有 N 个待测样品）

取(N+3)组 12 个一组的反应管，按顺序第一组 12 管中全部加入 2μL 的 NG-DW，第二组 12管中全部加入 2μL的 NG-Ecoli，第三组 12 管中全部加入 2μL 的样品 1 模板，第四组 12 管中全部加入 2μL 的样品 2 模板，…，最后组 12 管中全部加入 2μL 的PG-Ecoli。

盖好 PCR 管盖后，涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行 PCR 扩增反应。

3.扩增反应（扩增及产物分析区）

按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择 FAM 通道）

PCR 循环

荧光收集位点

37℃

10 分钟

1 个循环

—

95℃

10 分钟

1 个循环

—

95℃

30 秒

30 个循环

—

63 ℃

30 秒

—

72℃

90 秒

※

72℃

5 分钟

1 个循环

—

4.产物电泳（扩增及产物分析区）

称量 4. 0g 琼脂糖粉，加入至 200 mL 的 1×TAE 电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至 60℃右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为 0.5μg/mL， 充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于 10cm，厚度宜为 3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴。向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液，液面高于胶面 1mm~2mm。将5μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源，根据公式： 电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳 30min~45min 后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。

u  可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸荧光染料替代 EB。

u  推荐使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 条带的 Marker。

◆    结果分析

1.阴阳性判读：

进行电泳检测时，需对比 Marker 进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性； 否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量 PCR 仪检测时，检测孔Ct≤30 时判断该孔为阳性；当检测孔Ct＞30 时， 该检测孔为阴性）

示例电泳图

2.有效性判读：

需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中 uidA 泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。

3.结果判读：

在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：

致泻大肠埃希氏菌类别

目标条带的种类组合

EIEC

ipaH（＋）

uidA

（＋／－）

EAEC

aggR，astA，pic 中一条或一条以上阳性

EPEC

bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）

STEC/EHEC

stx1，stx2 中一条或一条以上阳性，eae（＋／－），bfpB（－）

ETEC

lt，stp，sth 中一条或以上阳性

u  97%以上大肠埃希氏菌为 uidA 阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；

u  当结果判定为EPEC 阳性时，若 bfpB 靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC；若 bfpB 靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC；

当结果判定为STEC/EHEC 阳性时，若 eae 靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC；若 eae 靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC。