质粒(plasmid) 广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中（但酵母除外，酵母的2 μm质粒存在于细胞核中），具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。

目前有许多方法用于从细菌中提纯质粒 DNA ， 这些方法都主要包括有以下 3 个步骤：

1. 细菌培养物的生长。

2. 细菌的收获和裂解

3. 质粒 DNA 的纯化。

（一）细菌培养物的生长

从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中 (有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如 pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准 LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒 DNA 。然而，较长一代的载体 (如 pBR322) 由于不能如此自由地复制， 所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时， 以便对质粒进行性扩增。 氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成， 结果阻止了细菌染色体的复制， 然而，松弛型质粒仍可继续复制， 在若干小时内， 其拷贝数持续递增。 这样，像 pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素 μg/ml) 已成为标准的操作、用该方法提取的质粒 DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

（二）细菌的收获和裂解

细菌的收获可通过离心来进行， 而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种， 这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。 选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒 DNA 的技术。

1)大质粒 (大于 15kb) 容易受损， 故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。 将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和 EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入 SDS 一类去污剂溶解球形体。 这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌部把质粒释放出来所需要的作用力。

2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入 EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌

暴露于去污剂， 通过煮沸或碱处理使之裂解。 这些处理可破坏碱基配对， 故可使宿主的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA 链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3)一些大肠杆菌菌株 (如 HB101 的一些变种衍生株 ) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类， 当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。 糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒 DNA 内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如 HB101 和 TG1 等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

4)当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌菌株 (endA+ 株，如 HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。 因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在温育 (如用限制酶消化 )时，质粒 DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤 (用酚：氯仿进行抽提 )可以避免此问题。

(三)质粒 DNA 的纯化

常使用的所有纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与 DNA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状 DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒 DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限， 可继续结合更多的染料， 直至达到饱和 ( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子 ) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环 DNA 分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。 多年来， 氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒 DNA 的方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。

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